高毒力耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌中染色体介导的 colistin 耐药性的流行病学特征

背景：高毒力耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（hv-CRKP）构成了重大的临床威胁。Colistin 是应对 hv-CRKP 的最后防线药物，但由染色体突变驱动的耐药性在其流行率和功能影响方面的特征仍不明确。方法：2020年至2023年期间，从中国一家三级医院收集了239株非重复临床 hv-CRKP 分离株。通过多位点序列分型、抗菌药物敏感性试验、常规 PCR 筛查以及对 mcr、pmrAB、phoPQ、crrAB 和 mgrB 进行靶向测序对分离株进行了分析。RT-qPCR 评估了脂质 A 修饰基因的表达。对 colistin 耐药株进行了全基因组测序。利用 CRISPR-Cas9 基因组编辑验证了新型 pmrB 突变的功能作用。通过生长动力学、竞争实验、大蜡螟（Galleria mellonella）感染模型和转录组学分析评估了适应度、毒力和基因表达变化。结果：大多数分离株（210/239，87.87%）属于 ST11 谱系，且未检测到 mcr 基因。pmrB 突变高度普遍（232/239，97.07%），其中 R256G 代表谱系相关多态性，而特定变异（P95L、D150H、T157P、S203P）与 colistin MIC 升高相关。6.28%（15/239）的分离株中鉴定出 mgrB 改变，且仅在 colistin 耐药菌株中观察到，而携带 crrB 变异的分离株（17/239，7.11%）对 colistin 仍保持敏感。pmrB 的 HAMP 和 HisKA 结构域突变与 colistin MIC 升高以及脂质 A 修饰基因的上调相关。使用 CRISPR-Cas9 的功能验证证实，两种新型 pmrB 变异（D150H 和 S203P）在 ST11-KL25 分离株中赋予了耐药性，因为回复突变恢复了对 colistin 的敏感性并在 colistin 压力下削弱了细菌生长。转录组分析表明，回复突变抑制了脂质 A 修饰通路（arnA-D、eptA）。尽管在 colistin 压力下具有适应度优势，但大蜡螟（G. mellonella）感染模型中的毒力实验显示 pmrB 突变株保留了全部致病潜力。结论：染色体 pmrB 突变和破坏性 mgrB 改变是临床 hv-CRKP 中 colistin 耐药的主要机制。耐 colistin 的 ST11-KL64/KL25 hv-CRKP 的出现突显了开展持续基因组监测和制定有效治疗策略以减轻其日益增长的公共卫生威胁的紧迫需求。