Dynamik von Staphylococcus aureus Cas9 in der DNA-Zielassoziation und -dissociation

Staphylococcus aureus Cas9 (SaCas9) ist eine RNA-geführte Endonuklease, die komplementäre DNA neben einem protospacer adjacent motif (PAM) zur Spaltung anvisiert. Ihre kleine Größe erleichtert die in vivo Abgabe für die Genom-Editing in verschiedenen Organismen. Hier untersuchen wir systematisch den Mechanismus von SaCas9 und dessen Wechselspiel mit DNA mittels Einzelmolekül- und Ensembleansätzen. Wir stellen fest, dass die DNA-Bindung und Spaltung von SaCas9 komplementäre 6- und 18-bp von PAM-proximaler DNA mit der Leit-RNA erfordern. Diese Aktivitäten werden durch zwei stabile Wechselwirkungen im ternären Komplex vermittelt, von denen eine ungefähr 6 bp vom PAM entfernt liegt und über der offensichtlichen Fußabdruck von SaCas9 auf DNA hinausgeht. Bemerkenswert ist, dass die andere Wechselwirkung innerhalb des Protospacers signifikant stark ist und somit gebundenes SaCas9 eine anhaltende Blockade für DNA-verfolgende Motoren darstellt. Interessanterweise gibt SaCas9 nach der Spaltung autonom die PAM-distale DNA frei, während es an das PAM gebunden bleibt. Diese partielle DNA-Freisetzung hebt sofort die starke Wechselwirkung mit der Protospacer-DNA auf und fördert folglich die anschließende Dissoziation vom PAM. Insgesamt bieten diese Daten ein dynamisches Verständnis von SaCas9 und leiten dessen effektive Anwendungen an.