通过LC/UV/MS在肝微粒体中进行高通量代谢软点识别：单变量孵育时间方法的应用

由CYP介导的快速代谢可能导致生物利用度差、药物清除快和显著的药物相互作用。因此，在药物发现过程中，通常会在人体肝微粒体（HLM）中进行代谢稳定性筛选，随后进行代谢软点识别（MSSID）。在MSSID实验中，常采用固定单一或多个孵育时间的测试化合物与肝微粒体的孵育，以及利用高分辨率质谱对代谢物进行定量和定性分析。本研究的主要目标是开发和验证一种简单、有效且高通量的检测方法，用于利用单变量孵育时间和LC/UV/MS确定测试化合物在肝微粒体中的代谢软点。模型化合物（维拉帕米、右美沙芬、布斯哌乐、米氮平、赛洛伐他汀、美氟氯噻噻美、阿莫地喹）以3或5 µM的浓度与HLM孵育，单变量孵育时间为1至60分钟，基于预先确定的代谢稳定性数据。结果显示，母体化合物的消失率约为20-40%，且仅生成一两个主要代谢物，并且没有显著形成次级代谢物。来自最佳孵育条件的独特代谢物谱使得LC/UV能够进行直接定量估算，从而识别主要代谢物。因此，通过LC/MS进行的结构鉴定主要集中在一两个主要的初级代谢物而非包括次级代谢物在内的许多代谢物。此外，利用通用的数据依赖采集方法，使Q-TOF和Qtrap能够持续记录主要代谢物的全MS和MS/MS光谱数据，以供后期的数据挖掘和解析。从对七种模型化合物代谢软点的分析结果表明，新的MSSID实验可以显著简化代谢软点的识别，且非常适合于领先化合物优化中的高通量分析。