Agarose-Gel-Elektrophorese zur Trennung von DNA-Fragmenten

Die Agarose-Gel-Elektrophorese ist der effektivste Weg, DNA-Fragmente unterschiedlicher Größen von 100 bp bis 25 kb zu trennen. Agarose wird aus den Algen-Gattungen Gelidium und Gracilaria isoliert und besteht aus wiederholten Agarobiose-(L- und D-Galaktose)-Untereinheiten. Während der Gelierung assoziieren Agarose-Polymere nicht-kovalent und bilden ein Netzwerk aus Bündeln, deren Porengrößen die molekularen Siebeigenschaften eines Gels bestimmen. Der Einsatz der Agarose-Gel-Elektrophorese revolutionierte die Trennung von DNA. Vor der Einführung von Agarose-Gelen wurde DNA hauptsächlich durch Zuckerdichtegradienten-Zentrifugation getrennt, was nur eine ungefähre Größenbestimmung ermöglichte. Um DNA mittels Agarose-Gel-Elektrophorese zu trennen, wird die DNA in vorgeformte Taschen im Gel geladen und ein elektrischer Strom angelegt. Das Phosphatgerüst des DNA-(und RNA)-Moleküls ist negativ geladen, daher wandern DNA-Fragmente in einem elektrischen Feld zur positiv geladenen Anode. Da DNA ein einheitliches Masse/Ladungs-Verhältnis hat, werden DNA-Moleküle innerhalb eines Agarose-Gels nach Größe in einem Muster getrennt, so dass die zurückgelegte Distanz umgekehrt proportional zum Logarithmus ihres Molekulargewichts ist. Das führende Modell für die Bewegung von DNA durch ein Agarose-Gel ist die "biased reptation", wobei die Vorderkante vorwärts bewegt wird und den Rest des Moleküls mitzieht. Die Migration eines DNA-Moleküls durch ein Gel wird durch Folgendes bestimmt: 1) Größe des DNA-Moleküls; 2) Agarose-Konzentration; 3) DNA-Konformation; 4) angelegte Spannung; 5) Vorhandensein von Ethidiumbromid; 6) Art der Agarose; und 7) Elektrophoresepuffer. Nach der Trennung können die DNA-Moleküle unter UV-Licht nach Färbung mit einem geeigneten Farbstoff visualisiert werden. Durch Befolgung dieses Protokolls sollten die Studenten in der Lage sein: 1. Den Mechanismus zu verstehen, durch den DNA-Fragmente innerhalb einer Gelmatrix getrennt werden. 2. Zu verstehen, wie die Konformation des DNA-Moleküls seine Mobilität durch eine Gelmatrix bestimmt. 3. Eine Agarose-Lösung geeigneter Konzentration für ihre Bedürfnisse zu identifizieren. 4. Ein Agarose-Gel zur Elektrophorese von DNA-Proben vorzubereiten. 5. Das Gel-Elektrophorese-Gerät und die Stromversorgung einzurichten. 6. Eine geeignete Spannung für die Trennung von DNA-Fragmenten auszuwählen. 7. Den Mechanismus zu verstehen, durch den Ethidiumbromid die Visualisierung von DNA-Banden ermöglicht. 8. Die Größen der getrennten DNA-Fragmente zu bestimmen.