Rapid detection and characterization from field cases of infectious laryngotracheitis virus by real-time polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism

A real-time polymerase chain reaction (PCR) assay was developed to specifically amplify infectious laryngotracheitis virus (ILTV) DNA from field samples. The 222-base-pair PCR fragment was amplified using primers located in a conserved region of the infected cell protein 4 gene that was demonstrated in this work to encompass a single nucleotide polymorphism. Subsequent restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis of real-time PCR amplified fragments from a range of ILTV isolates using the restriction endonuclease MspI enabled differentiation between older ILTV isolates that were prevalent in the 1960s prior to the availability of vaccine strains and more recent isolates that predominantly are identical to vaccine strains. The assay, using real-time PCR, RFLP and sequence analysis, was used to characterize two recent field cases of infectious laryngotracheitis from Northern Ireland. One of the field cases was demonstrated to be similar to older “wild-type” isolates, while the other field case was identified to have a concurrent ILTV infection of both “wild-type” and vaccinal type origin. The assay described here using real-time PCR and RFLP provides a rapid, specific method that enables detection and characterization of ILTV directly from field cases. Détection et caractérisation rapides du virus de la laryngotrachéite infectieuse (ILTV) à partir de cas du terrain par PCR en temps réel et par polymorphisme de taille des fragments de restriction (RFLP) Un test d'amplification en chaîne par polymérase (PCR) en temps réel a été développé pour amplifier spécifiquement l'ADN du virus de la laryngotrachéite infectieuse (ILTV) à partir d'échantillon du terrain. Le fragment PCR de 222 bp a été amplifié en utilisant des amorces localisées dans une région conservée du gène de la protéine 4 des cellules infectées (ICP-4). Il a été démontré dans cette étude que cette région comprenait un seul polymorphisme nucléotidique (SNP). L'analyse ultérieure du polymorphisme de taille des fragments de restriction (RFLP) amplifiés par PCR en temps réel à partir de souches différentes de ILTV en utilisant l'endonucléase de restriction MspI, a permis la différentiation des souches anciennes de ILTV qui étaient prévalentes dans les années 1960 avant la mise à disposition des souches vaccinales, des souches plus récentes qui de façon prédominante sont identiques aux souches vaccinales. La méthode utilisant la PCR en temps réel, la RFLP et l'analyse de la séquence a été employée pour caractériser deux cas récents de ILT en Irlande du Nord. Il a été démontré qu'un des cas du terrain était de type similaire aux souches “sauvages” anciennes, alors que l'autre cas présentait une infection concomitante par deux virus ILT de type sauvage et d'origine vaccinale. L'essai décrit ici, utilisant la PCR en temps réel et la RFLP fournit une méthode spécifique et rapide qui permet la détection et la caractérisation des ILTV directement à partir des cas du terrain. Schnellnachweis und Charakterisierung des Virus der infektiösen Laryngotracheitis (ILTV) aus Feldinfektionen mittels Real Time-PCR und Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP) Es wurde ein Real Time-Polymerasekettenreaktions (PCR)-Test zur spezifischen Amplifizierung von DNS des Virus der infektiösen Laryngotracheitis (ILTV) aus Feldproben entwickelt. Das 222-bp-PCR-Fragment wurde unter Verwendung von Primern amplifiziert, die sich in einer konservierten Region des ICP 4 (infected cell protein 4) befanden, bei dem in dieser Arbeit gezeigt werden konnte, dass es einen einzelnen Nukleotidpolymorphismus umfasste. Die nachfolgende RFLP-Analyse der amplifizierten Real Time-PCR-Fragmente aus einer Reihe von ILTV-Isolaten mittels des Restriktionsendonuklease MspI ermöglichte die Differenzierung zwischen älteren Isolaten, die in den 1960iger Jahren vor der Verfügbarkeit von Vakzinestämmen vorkamen, und neueren Isolaten, die überwiegend mit den Impfstämmen übereinstimmten. Dieses Testverfahren mit Real Time-PCR, RFLP und Sequenzanalyse wurde zur Charakterisierung von zwei neueren ILT-Feldinfektionsfällen in Nordirland angewendet. Bei einem dieser Feldisolate konnte gezeigt werden, dass es einem der älteren ,,Wildtyp“-Isolate ähnlich war, während bei dem anderen Fall zwei konkurrierende ILTV-Infektionen mit einem “Wildtyp”- und einen Vakzinetypisolat auftraten. Mit dem hier beschriebenen Verfahren der Real Time-PCR und der RFLP steht eine schnelle und spezifische Methode zum Nachweis und zur Charakterisierung von ILTV direkt aus Feldinfektionsfällen zur Verfügung. Rápida detección y caracterización del Virus de Laringotraqueítis Infecciosa (ILTV) procedente de casos de campo mediante PCR a tiempo real y polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) Se puso a punto una técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a tiempo real para amplificar específicamente DNA de virus de laringotraqueítis infecciosa (ILTV) de muestras de campo. Se amplificó el fragmento de PCR de 222pb mediante el uso de cebadores localizados en una región conservada del gen de la proteína 4 de la célula infectada (ICP 4) para la cual se demostró en este estudio que incluye polimorfismos de un solo nucleótido (SNP). El análisis del polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) de los fragmentos amplificados de un rango de aislamientos de ILTV mediante el uso de la endonucleasa de restricción MspI, permitió la diferenciación entre aislamientos antiguos de ILTV que predominaron en los años 60 antes de la disponibilidad de cepas vacunales, y aislamientos más recientes que son en su mayoría idénticos a las cepas vacunales. El estudio, utilizando PCR a tiempo real, RFLP y análisis de las secuencias, sirvió para caracterizar dos casos recientes de campo de ILT de Irlanda del Norte. Se demostró que uno de los casos de campo era similar a antiguos aislamientos de tipo ‘campo’ mientras que el otro caso de campo se identificó como una infección concurrente de ambos tipos de ILTV, el de origen campo y vacunal. La técnica descrita aquí, basada en el uso de PCR a tiempo real y RFLP, proporciona un método rápido y específico que permite la detección y caracterización de ILTV directamente de casos de campo.