Novel Approaches in DNA Methylation Studies – MS-HRM Analysis and Electrochemistry

SouhrnMetylace cytozinů v DNA je jedním z epigenetických mechanizmů regulujících expresi genů, a hraje tak důležitou roli v diferenciaci nebo proliferaci buněk.V nádorových buňkách často dochází ke změnám v metylaci DNA, kupříkladu nadměrnou metylací (hypermetylací) promotorů tumor supresorových genů.Proto jsou vyvíjeny nové metody analýzy, které by byly schopny určit rozsah metylace konkrétní sekvence DNA.K těmto metodám se řadí i relativně levné a rychlé techniky MS-HRM (methylation-specific high resolution melting) a elektrochemie.Ve srovnání s jinými používanými metodami jsou vhodné pro screening většího počtu vzorků či více cílových oblastí DNA.MS-HRM svou citlivostí a relativní nenáročností konkuruje ostatním zavedeným metodám, jako jsou metylačně-specifická PCR nebo přímá bisulfitová sekvenace.Elektrochemie nabízí nenáročné přístrojové vybavení a při použití vhodných elektroaktivních molekul a elektrodových povrchů i několik zajímavých strategií rozlišení cytozinů a metylcytozinů.Obě techniky byly již úspěšně použity při stanovení metylace DNA promotorů důležitých tumor supresorových genů a mohly by tak v budoucnu přispět ke zpřesnění dia gnostiky a prognostiky onkologických onemocnění.Aberantní metylace promotorů byla popsána již u stovek genů se vztahem k nádorovým onemocněním a s rozvojem metod, jež by umožňovaly jejich detekci i v klinické praxi, by se řada z nich mohla stát novými důležitými bio markery. Klíčová slovaDNA metylace -5-metylcytozin -HRM analýza -teplota tání -DNA duplex -elektrochemiehybridizace nukleových kyselin SummaryCytosine methylation in DNA is an epigenetic mechanism regulating gene expression and plays a vital role in cell differentiation or proliferation.Tumor cells often exhibit aberrant DNA methylation, e.g.hypermethylation of tumor suppressor gene promoters.New methods, capable of determining methylation status of specific DNA sequences, are thus being developed.Among them, MS-HRM (methylation-specific high resolution melting) and electrochemistry offer relatively inexpensive instrumentation, fast assay times and possibility of screening multiple samples/DNA regions simultaneously.MS-HRM is due to its sensitivity and simplicity an interesting alternative to already established techniques, including methylation-specific PCR or bisulfite sequencing.Electrochemistry, when combined with suitable electroactive labels and electrode surfaces, has been applied in several unique strategies for discrimination of cytosines and meth ylcytosines.Both techniques were successfully tested in analysis of DNA methylation within promoters of important tumor suppressor genes and could thus help in achieving more precise diagnostics and prognostics of cancer.Aberrant methylation of promoters has already been described in hundreds of genes associated with tumorigenesis and could serve as important biomarker if new methods applicable into clinical practice are sufficiently advanced.