Knockdown do RNA Longo Não Codificante ZEB1-AS1 Acelera a Hipertrofia Cardíaca pela Via miR-186-5p/HDAC2

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  Figura 1. – Superexpressão de ZEB1-AS1 em tecidos com HVE e em células AC16 estimuladas com ISO. A) Expressão de ZEB1-AS1 em corações com HVE (n = 20) versus doadores normais (n = 10) por qRT-PCR; B) Área de superfície de células AC16 após tratamento com PBS ou ISO, avaliada por coloração por imunofluorescência; C) Níveis de mRNA de BNP, ANP e β-MHC em células AC16 após PBS ou ISO por qRT-PCR; D) Níveis de proteína de BNP, ANP e β-MHC em células AC16 após PBS ou ISO por Western blot; E) Expressão de ZEB1-AS1 em células AC16 após PBS ou ISO por qRT-PCR. Todos os experimentos foram realizados em triplicata. *p < 0,05, *p < 0,01. ANP: peptídeo natriurético atrial; BNP: peptídeo natriurético tipo B; β-MHC: cadeia pesada de miosina β; HC: hipertrofia cardíaca; HVE: hipertrofia ventricular esquerda; ISO: isoproterenol; PBS: solução salina tamponada com fosfato; qRT-PCR: reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real.

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  Figura 2. – A deficiência de ZEB1-AS1 atenua a HC induzida por ISO em células AC16. A) Expressão de ZEB1-AS1 em células AC16 transfectadas com sh-NC ou sh-ZEB1-AS1 por qRT-PCR; B) área de superfície das AC16 após estimulação com ISO com sh-NC ou sh-ZEB1-AS1, avaliada por coloração por imunofluorescência; C) níveis de mRNA de BNP, ANP e β-MHC em AC16 estimuladas com ISO com sh-NC ou sh-ZEB1-AS1 por qRT-PCR; D) níveis de proteína de BNP, ANP e β-MHC em AC16 estimuladas com ISO com sh-NC ou sh-ZEB1-AS1 por Western blot. Todos os experimentos foram realizados em triplicata. *p < 0,05, *p < 0,01. ANP: peptídeo natriurético atrial; BNP: peptídeo natriurético tipo B; β-MHC: cadeia pesada de miosina β; HC: hipertrofia cardíaca; ISO: isoproterenol; qRT-PCR: reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real; sh-NC: short hairpin RNA–negative control; sh-ZEB1-AS1: shRNA direcionado a ZEB1-AS1.

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  Figura 3. – ZEB1-AS1 regula HDAC2 ao sequestrar miR-186-5p. A) Sítio previsto de ligação de miR-186-5p em ZEB1-AS1 (WT) e construto mutante (MUT) correspondente. B) Ensaio de dupla luciferase mostrando redução da atividade do repórter para ZEB1-AS1-WT, mas não para ZEB1-AS1-MUT, na presença do mimic de miR-186-5p. C) Sítio previsto de ligação de miR-186-5p na 3′-RNT de HDAC2 (WT) e construto MUT. D) Ensaio de dupla luciferase mostrando diminuição da atividade para HDAC2-WT, mas não para HDAC2-MUT, com mimic de miR-186-5p. E) RIP demonstrando enriquecimento de ZEB1-AS1, miR-186-5p e HDAC2 em imunoprecipitados com Ago2. F-G) Níveis de miR-186-5p e de HDAC2 em corações com HVE (n = 20) versus doadores normais (n = 10) por qRT-PCR. Todos os experimentos foram realizados em triplicata. *p < 0,05, *p < 0,01. Ago2: Argonauta-2; CMV: citomegalovírus; HDAC2: desacetilase de histonas 2; LVH: hipertrofia ventricular esquerda; miR-NC: mimic de controle negativo; MUT: mutante; qRT-PCR: reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real; RIP: imunoprecipitação de RNA; RNT: região não traduzida; WT: wild type.

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  Figura 4. – ZEB1-AS1 promove a HC ao regular a via miR-186-5p/HDAC2. A) mRNA de HDAC2 em células AC16 estimuladas com ISO e transfectadas com os construtos indicados, medido por qRT-PCR; B) área de superfície das AC16 após estimulação com ISO e transfecção com os construtos indicados, avaliada por coloração por imunofluorescência; C) níveis de mRNA de BNP, ANP e β-MHC em AC16 estimuladas com ISO após transfecção, medidos por qRT-PCR; D) níveis de proteína de BNP, ANP e β-MHC em AC16 estimuladas com ISO após transfecção, medidos por Western blot. Todos os experimentos foram realizados em triplicata. *p < 0,05, *p < 0,01. ANP: peptídeo natriurético atrial; BNP: peptídeo natriurético tipo B; β-MHC: cadeia pesada de miosina β; HC: hipertrofia cardíaca; HDAC2: histone deacetylase 2; ISO: isoproterenol; qRT-PCR: reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real; sh-NC: short hairpin RNA–negative control; sh-ZEB1-AS1: zinc finger E-box binding homeobox 1 antisense RNA 1 direcionado ao short hairpin RNA.

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  Figure 1. – Upregulation of ZEB1-AS1 in LVH tissues and ISO-stimulated AC16 cells. A) ZEB1-AS1 expression in LVH hearts (n = 20) versus normal donors (n = 10) by qRT-PCR. B) AC16 cell surface area after PBS or ISO treatment assessed by immunofluorescence. C) mRNA levels of BNP, ANP, and β-MHC in AC16 cells after PBS or ISO by qRT-PCR. D) Protein levels of BNP, ANP, and β-MHC in AC16 cells after PBS or ISO by Western blot. E) ZEB1-AS1 expression in AC16 cells after PBS or ISO by qRT-PCR. All experiment was performed in triplicate. *p < 0.05, **p < 0.01. ANP: atrial natriuretic peptide; BNP: B-type natriuretic peptide; β-MHC: beta-myosin heavy chain; CH: cardiac hypertrophy; ISO: isoproterenol; LVH: left ventricular hypertrophy; PBS: phosphate-buffered saline; qRT-PCR: quantitative real-time polymerase chain reaction.

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  Figure 2. – ZEB1-AS1 deficiency mitigates ISO-induced CH in AC16 cells. A) ZEB1-AS1 expression in AC16 cells transfected with sh-NC or sh-ZEB1-AS1 by qRT-PCR; B) AC16 cell surface area after ISO stimulation with sh-NC or sh-ZEB1-AS1 assessed by immunofluorescence; C) mRNA levels of BNP, ANP, and β-MHC in ISO-stimulated AC16 cells with sh-NC or sh-ZEB1-AS1 by qRT-PCR; D) protein levels of BNP, ANP, and β-MHC in ISO-stimulated AC16 cells with sh-NC or sh-ZEB1-AS1 by Western blot. All experiments were performed in triplicate. *p < 0.05, **p < 0.01. ANP: atrial natriuretic peptide; BNP: B-type natriuretic peptide; β-MHC: beta-myosin heavy chain; CH: cardiac hypertrophy; ISO: isoproterenol; qRT-PCR: quantitative real-time polymerase chain reaction; sh-NC: short hairpin RNA–negative control; sh-ZEB1-AS1: ZEB1-AS1-targeting shRNA.

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  Figure 3. – ZEB1-AS1 regulates HDAC2 by sequestering miR-186-5p. A) Predicted miR-186-5p binding site in ZEB1-AS1 (WT) and corresponding mutant (MUT) construct. B) Dual-luciferase assay showing reduced reporter activity for ZEB1-AS1-WT, but not ZEB1-AS1-MUT, in the presence of miR-186-5p mimic. C) Predicted miR-186-5p binding site in the HDAC2 3′-UTR (WT) and MUT construct. D) Dual-luciferase assay showing decreased activity for HDAC2-WT, but not HDAC2-MUT, with miR-186-5p mimic. E) RIP demonstrating enrichment of ZEB1-AS1, miR-186-5p, and HDAC2 in Ago2 immunoprecipitates. F-G) miR-186-5p and HDAC2 levels in LVH hearts (n = 20) versus normal donors (n = 10) by qRT-PCR. All experiments were performed in triplicate. *p < 0.05, **p < 0.01. Ago2: Argonaute-2; CMV: cytomegalovirus; HDAC2 histone deacetylase 2; LVH: left ventricular hypertrophy; miR-NC: negative-control mimic; MUT: mutant; qRT-PCR: quantitative real-time polymerase chain reaction; RIP: RNA immunoprecipitation; UTR: untranslated region; WT: wild type.

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  Figure 4. – ZEB1-AS1 promotes CH by regulating the miR-186-5p/HDAC2 pathway. A) HDAC2 mRNA in ISO-stimulated AC16 cells transfected with the indicated constructs measured by qRT-PCR; B) AC16 cell surface area after ISO stimulation and transfection with the indicated constructs assessed by immunofluorescence; C) mRNA levels of BNP, ANP, and β-MHC in ISO-stimulated AC16 cells after transfection measured by qRT-PCR; D) protein levels of BNP, ANP, and β-MHC in ISO-stimulated AC16 cells after transfection measured by Western blot. All experiments were performed in triplicate. *p < 0.05, **p < 0.01. ANP: atrial natriuretic peptide; BNP: B-type natriuretic peptide; β-MHC: beta-myosin heavy chain; CH: cardiac hypertrophy; HDAC2: histone deacetylase 2; ISO: isoproterenol; qRT-PCR: quantitative real-time polymerase chain reaction; sh-NC: short hairpin RNA–negative control; sh-ZEB1-AS1: zinc finger E-box binding homeobox 1 antisense RNA 1-targeting short hairpin RNA; miR-186-5p: microRNA-186-5p.