Consequências funcionais das alterações em Glu309, Glu771 e Asp800 na Ca(2+)-ATPase do retículo sarcoplasmático.

A mutagênese direcionada foi usada para substituir Glu309, Glu771 e Asp800 na Ca(2+)-ATPase do retículo sarcoplasmático do músculo rápido de coelho por seus correspondentes amidas. Esses resíduos são previstos para estar no domínio transmembranar e foram sugeridos como ligantes de oxigênio para a ligação de Ca2+ em locais de alta afinidade (Clarke, D. M., Loo, T. W., Inesi, G., e MacLennan, D. H. (1989) Nature 339, 476-478). Os mutantes Glu309----Gln e Asp800----Asn não conseguiram formar um fosfoenzima a partir de ATP nas concentrações de Ca2+ analisadas (até 12.5 mM), enquanto o mutante Glu771----Gln foi fosforilado a partir de ATP a 2.5 mM de Ca2+. Em todos os três mutantes, Ca2+ em concentrações bem abaixo de 12.5 mM impediu ou inibiu a fosforilação com Pi, sugerindo que pelo menos um local de ligação de cálcio estava funcionando em cada mutante. Nos mutantes Glu309----Gln e Glu771----Gln, o intermediário de fosfoenzima insensível ao ADP foi incomumente estável, como indicado por uma taxa de desfosforilação muito baixa observada em experimentos cinéticos e por uma afinidade aparente aumentada por Pi determinada em experimentos de fosforilação em equilíbrio. Esses dados indicam um papel central de Glu309 e Glu771 nas mudanças conformacionais de transdução de energia e/ou na ativação da hidrólise do fosfoenzima.